研究紹介
シトクロムP450を利用するバイオ触媒の開発
第2章: デコイ分子を用いたP450BM3等の機能改変
第5話「鉄以外の中心金属を持つP450BM3の作成」
酵素の反応性、選択性を制御する手法として最も確立された手法に天然の酵素に用いられているアミノ酸を別のアミノ酸に置き換える変異導入法があり、P450BM3においても、2018年ノーベル化学賞受賞のF. H. Arnold教授を始め、世界中の研究者が数々の変異体を作成し、成功を収めている。一方、変異導入法と独立して、我々はデコイ分子という化学合成可能な添加物を加えることで、P450BM3の基質特異性の変換、立体選択性の制御に成功した。しかし、どちらの手法も酵素反応が行われている活性中心はヘムと呼ばれる鉄錯体であり、基本的な性質はヘムに強く依存している。酵素の特性を大きく変換するためには、活性中心の錯体を別の錯体に置換する「再構成」と呼ばれる手法が研究されており、ミオグロビンや我々の研究室で行われているヘム獲得タンパク質HasAなどで適用されている。我々はP450BM3の新しい機能を求め、P450BM3の再構成を試みたが従来法では困難であった。これはP450BM3の持つ複雑な構造に起因する。通常、P450は活性中心であるヘムを有するヘムドメイン単体で構成され、ヘムに電子を受け渡す還元酵素をパートナーとして必要とするが、P450BM3はヘムドメインと還元酵素が連結した一体型の構造を有している（この一体型の構造がP450の中でも極めて反応速度が速い理由である）。このようにP450BM3は通常のP450と異なり複雑な構造を有しているため、既存の再構成法では、途中で酵素機能を失いやすく、機能を保持した再構成体を得られる確率が非常に低い。
そこでP450BM3をヘムドメインと還元ドメインに分割し、ヘムドメインのみで再構成後、還元ドメインと連結することで全長のP450BM3再構成体を作成することにした。ヘムドメインの再構成は以前に我々が開発した再構成法（鉄を含まない培地でヘムを持たないヘムドメインのアポ体を発現し、別の錯体を再構成させる）を用い、還元ドメインとの連結にはペプチド連結酵素SrtAを用いた。この手法によって、中心金属が鉄の代わりにマンガンを有するP450BM3再構成体の作成に成功した。マンガンを有するP450BM3再構成体は、天然の鉄含有P450BM3と同様にデコイ分子存在下、プロパンの水酸化が可能であったが、生成物の2-プロパノールと1-プロパノールの比率が大きく異なり、活性中心の錯体を交換することで、酵素の反応特性を大きく変換することが可能となった。
詳しくはこちらの論文をご参照下さい。
- K. Omura, Y. Aiba, H. Onoda, J. K. Stanfield, S. Ariyasu, H. Sugimoto, Y. Shiro, O. Shoji, Y. Watanabe,"Reconstitution of Full-Length P450BM3 with an Artificial Metal Complex by Utilising the Transpeptidase Sortase A" , Chem. Commun., 54, 7892-7895(2018)
10.1039/C8CC02760A